Разширяване на ферментацията: Цялостно ръководство за глобален биотехнологичен напредък

Ферментацията, метаболитен процес, който превръща захари в киселини, газове или алкохол, е крайъгълен камък в различни индустрии, включително хранително-вкусовата, фармацевтичната, биогоривата и индустриалните ензими. Разширяването на ферментационните процеси, преминаването от лабораторно към промишлено производство, представлява значителни предизвикателства и изисква задълбочено разбиране на принципите на биопроцесното инженерство. Това ръководство предоставя цялостен преглед на разширяването на ферментацията, обхващайки ключови концепции, предизвикателства, технологии и стратегии за успешна оптимизация на биопроцеси в различни индустрии по света.

Защо е важно разширяването на ферментацията?

Способността за ефективно разширяване на ферментационните процеси е от решаващо значение за комерсиализацията на биотехнологични иновации. Въпреки че на лабораторно ниво могат да се постигнат обещаващи резултати, пренасянето им в широкомащабно производство изисква внимателно разглеждане на различни фактори, включително:

• Поддържане на производителността на процеса: Гарантиране, че желаният добив, качество и производителност на продукта се запазват при увеличаване на мащаба.
• Рентабилност: Оптимизиране на процеса за минимизиране на производствените разходи и максимизиране на рентабилността.
• Съответствие с регулациите: Посрещане на строгите регулаторни изисквания за безопасност и ефикасност на продуктите на различни световни пазари.
• Посрещане на пазарното търсене: Производство на достатъчни количества от продукта за задоволяване на пазарното търсене.

Успешното справяне със сложностите на разширяването на ферментацията е от съществено значение за компаниите, които искат да комерсиализират своите биотехнологични продукти и да придобият конкурентно предимство на световния пазар. Например, фармацевтична компания, разработваща нов антибиотик чрез микробна ферментация, трябва да гарантира, че ферментационният процес може да бъде разширен, за да се произведе лекарството в достатъчни количества, които да отговорят на нуждите на пациентите по целия свят. По същия начин, компания за биогорива, която цели да произвежда етанол от лигноцелулозна биомаса, трябва да оптимизира ферментационния процес за широкомащабно производство, за да превърне биогоривата в жизнеспособна алтернатива на изкопаемите горива.

Ключови принципи при разширяване на ферментацията

Успешното разширяване на ферментацията се основава на няколко фундаментални принципа на биопроцесното инженерство. Разбирането и прилагането на тези принципи е от решаващо значение за постигане на оптимална производителност на процеса в промишлен мащаб.

1. Поддържане на постоянен обемен коефициент на масопренасяне (kLa)

Преносът на кислород често е ограничаващ фактор при аеробните ферментационни процеси. Обемният коефициент на масопренасяне (kLa) е ключов параметър, който описва скоростта, с която кислородът се пренася от газовата фаза в течната фаза в биореактора. Поддържането на постоянен kLa по време на разширяването е от съществено значение, за да се гарантира, че клетките получават достатъчно кислород за растеж и образуване на продукт. Това може да се постигне чрез регулиране на параметри като скорост на разбъркване, скорост на аериране и геометрия на биореактора.

Например, при производството на лимонена киселина от Aspergillus niger, ограничаването на кислорода може значително да намали добива на лимонена киселина. Поддържането на достатъчен kLa през целия ферментационен процес е от решаващо значение за максимизиране на производството на лимонена киселина. Могат да се използват различни стратегии за подобряване на преноса на кислород, като например използване на обогатен с кислород въздух или оптимизиране на дизайна на перката.

2. Поддържане на постоянно време на смесване

Ефективното смесване е от решаващо значение за осигуряване на хомогенност в биореактора, предотвратяване на ограничения на субстрата или хранителните вещества и разсейване на топлината. Поддържането на постоянно време на смесване по време на разширяването е важно, за да се гарантира, че клетките изпитват еднаква среда и че градиентите на хранителни вещества, pH и температура са сведени до минимум. Времето за смесване може да бъде повлияно от фактори като дизайн на перката, скорост на перката и геометрия на биореактора.

Разгледайте производството на рекомбинантни протеини в култури от бозайникови клетки. Клетките на бозайниците са чувствителни на срязване и прекомерното разбъркване може да увреди клетките и да намали добива на протеин. Въпреки това, недостатъчното смесване може да доведе до ограничения в хранителните вещества и слепване на клетки. Оптимизирането на времето за смесване за балансиране на тези конкурентни фактори е от решаващо значение за успешното разширяване.

3. Поддържане на постоянна скорост на срязване

Скоростта на срязване, скоростта, с която съседни слоеве флуид се движат един спрямо друг, може да има значително въздействие върху жизнеспособността на клетките и качеството на продукта, особено за чувствителни на срязване клетки като клетки на бозайници и растителни клетки. Поддържането на постоянна скорост на срязване по време на разширяването е важно за минимизиране на увреждането на клетките и осигуряване на постоянно качество на продукта. Скоростта на срязване може да се контролира чрез регулиране на параметри като скорост и дизайн на перката.

Например, при производството на моноклонални антитела в CHO клетки, прекомерният стрес от срязване може да доведе до клетъчна лиза и освобождаване на вътреклетъчни протеази, които могат да разградят антителата. Използването на перки с ниско срязване и оптимизирането на скоростта на разбъркване може да помогне за минимизиране на стреса от срязване и да подобри производството на антитела.

4. Поддържане на постоянна входяща мощност на единица обем (P/V)

Входящата мощност на единица обем (P/V) е мярка за енергията, вложена в биореактора за смесване и аериране. Поддържането на постоянен P/V по време на разширяването може да помогне да се гарантира, че характеристиките на смесване и пренос на кислород на биореактора са сходни при различни мащаби. Важно е обаче да се отбележи, че P/V не е единственият фактор, който влияе на смесването и преноса на кислород, и трябва да се вземат предвид и други параметри като дизайн на перката и геометрия на биореактора.

При много бактериални ферментации по-висока стойност на P/V може да бъде приемлива поради по-устойчивия характер на бактериалните клетки в сравнение с клетките на бозайниците. Въпреки това, дори при бактериални ферментации, прекомерното P/V може да доведе до увеличена консумация на енергия и потенциално до увреждане на клетките в някои случаи. Следователно оптимизирането на P/V в съчетание с други параметри е от решаващо значение.

5. Геометрична подобност

Поддържането на геометрична подобност по време на разширяването означава, че съотношенията на размерите на биореактора (напр. диаметър, височина, диаметър на перката) остават постоянни. Това може да помогне да се гарантира, че моделите на потока и характеристиките на смесване на биореактора са сходни при различни мащаби. Често обаче не е възможно да се поддържа перфектна геометрична подобност поради практически ограничения като разходи и ограничения на пространството. Освен това, перфектната геометрична подобност не гарантира идентична производителност, защото динамиката на флуидите не се диктува единствено от геометрията.

Например, геометрично подобни биореактори може да имат различни съотношения на повърхностна площ към обем, което може да повлияе на преноса на топлина и скоростта на изпаряване. Моделирането с изчислителна динамика на флуидите (CFD) може да се използва за оценка на въздействието на отклоненията от геометричната подобност върху производителността на биореактора.

Предизвикателства при разширяването на ферментацията

Разширяването на ферментационните процеси представлява множество предизвикателства, изискващи внимателно разглеждане на различни фактори, които могат да повлияят на производителността на процеса.

1. Ограничения в преноса на кислород

С увеличаване на мащаба на биореактора става по-трудно да се поддържа достатъчен пренос на кислород до клетките. Това е така, защото съотношението на повърхностна площ към обем намалява, а дифузионният път за кислород се увеличава. Ограничаването на кислорода може да доведе до намален растеж на клетките, образуване на продукт и дори клетъчна смърт.

Решения:

• Увеличаване на скоростта на аериране.
• Увеличаване на скоростта на разбъркване.
• Използване на обогатен с кислород въздух или чист кислород.
• Оптимизиране на дизайна на перката.
• Използване на биореактор с по-голямо съотношение на повърхностна площ към обем.
• Внедряване на стратегии като използване на микромехурчета или мембранна аерация.

2. Отвеждане на топлина

Ферментационните процеси генерират топлина поради метаболитната активност и разбъркването. С увеличаване на мащаба на биореактора става по-трудно да се отведе тази топлина, което може да доведе до повишена температура и намален растеж на клетките и образуване на продукт. Поддържането на оптимална температура е от решаващо значение за ензимната активност и общото здраве на клетките.

Решения:

• Използване на биореактор с охлаждаща риза или вътрешни охлаждащи серпентини.
• Увеличаване на дебита на охлаждащата течност.
• Използване на по-ефективна охладителна система.
• Оптимизиране на ферментационния процес за намаляване на генерирането на топлина.
• Обмисляне на изпарително охлаждане, ако е подходящо (и ако загубата на летливи продукти не е проблем).

3. Нехомогенност при смесването

С увеличаване на мащаба на биореактора става по-трудно да се поддържа равномерно смесване в целия съд. Това може да доведе до градиенти на хранителни вещества, pH и температура, което може да повлияе отрицателно на растежа на клетките и образуването на продукт. Мъртвите зони или лошо смесените региони също могат да насърчат натрупването на токсични странични продукти.

Решения:

• Оптимизиране на дизайна на перката.
• Увеличаване на скоростта на разбъркване.
• Използване на няколко перки.
• Оптимизиране на геометрията на биореактора.
• Използване на CFD моделиране за разбиране и оптимизиране на моделите на смесване.

4. Контрол на pH

Поддържането на оптимално pH е от решаващо значение за растежа на клетките и образуването на продукт. С увеличаване на мащаба на биореактора става по-трудно да се поддържа равномерно pH в целия съд. Това може да доведе до pH градиенти, което може да повлияе отрицателно на растежа на клетките и образуването на продукт. Метаболитните странични продукти могат значително да променят pH, изисквайки строг контрол.

Решения:

• Използване на система за контрол на pH с добавяне на киселина и основа.
• Оптимизиране на местоположението на pH сондата и точките за добавяне на киселина/основа.
• Използване на буфер за поддържане на стабилно pH.
• Обмисляне на използването на онлайн система за мониторинг и контрол на pH.

5. Контрол на пяната

Образуването на пяна е често срещан проблем при ферментационните процеси, особено тези, включващи протеини или повърхностноактивни вещества. Пяната може да доведе до намален работен обем, замърсяване и запушване на сензори и филтри. Тя също така възпрепятства преноса на кислород.

Решения:

• Добавяне на пеногасители.
• Оптимизиране на скоростта на разбъркване и аериране.
• Използване на механичен пеноразбивач.
• Обмисляне на използването на сензор за пяна за автоматично добавяне на пеногасители.

6. Промени в морфологията или физиологията

Клетките могат да проявят променена морфология или физиология с увеличаване на мащаба. Стресът от срязване или други промени в средата на биореактора могат да накарат клетките да произвеждат различни протеини или да имат различни темпове на растеж. Тези промени могат да повлияят на добива и качеството на продукта. Това е особено разпространено при нишковидни организми или агрегирани клетъчни култури.

Решения:

• Внимателно наблюдение на клетъчната морфология и физиология по време на разширяването.
• Регулиране на параметрите на ферментацията (напр. температура, pH, нива на хранителни вещества), за да се поддържа оптимален растеж на клетките и образуване на продукт.
• Обмисляне на използването на посевна линия за постепенно адаптиране на клетките към средата с по-голям мащаб.
• Използване на процесна аналитична технология (PAT) за наблюдение на критични параметри на процеса в реално време.

7. Поддържане на стерилност

Поддържането на стерилност е от решаващо значение за предотвратяване на замърсяване и осигуряване на качеството на продукта. С увеличаване на мащаба на биореактора става по-трудно да се поддържа стерилност поради увеличената повърхностна площ и увеличения брой връзки и точки за вземане на проби.

Решения:

• Използване на валидирани процедури за стерилизация за цялото оборудване и среди.
• Прилагане на строги асептични техники по време на работа.
• Използване на стерилни филтри за въздушни и газови потоци.
• Редовно наблюдение на биореактора за замърсяване.
• Осигуряване на правилно уплътняване на всички връзки и портове.

Технологии за разширяване на ферментацията

Налични са няколко технологии за подпомагане на разширяването и оптимизацията на ферментацията. Тези технологии могат да помогнат за преодоляване на предизвикателствата, свързани с разширяването на ферментационните процеси, и за подобряване на производителността на процеса.

1. Изчислителна динамика на флуидите (CFD)

CFD е мощен инструмент за симулиране на потока на флуиди, пренос на топлина и масопренасяне в биореактори. CFD може да се използва за оптимизиране на дизайна на биореактора, прогнозиране на моделите на смесване и идентифициране на мъртви зони. CFD моделирането може да помогне за прогнозиране на условията при по-големи мащаби въз основа на експерименти в малък мащаб, намалявайки броя на скъпите пилотни опити.

Пример: CFD може да се използва за оптимизиране на дизайна и разположението на перката в широкомащабен биореактор, за да се осигури равномерно смесване и пренос на кислород. Той може също да идентифицира зони с висок стрес от срязване, позволявайки на инженерите да коригират дизайна, за да минимизират увреждането на клетките.

2. Процесна аналитична технология (PAT)

PAT е система за проектиране, анализ и контрол на производството чрез своевременни измервания (т.е. по време на обработка) на критични качествени и производителни атрибути на суровини и материали в процес на обработка, с цел осигуряване на качеството на крайния продукт. Инструментите на PAT включват сензори за наблюдение на pH, температура, разтворен кислород, клетъчна плътност и нива на хранителни вещества. Придобиването на данни в реално време позволява незабавни корекции на ферментационния процес, което води до повишена ефективност и възпроизводимост.

Пример: Използването на онлайн спектрометър в близката инфрачервена област (NIR) за наблюдение на нивата на глюкоза във ферментационната среда позволява корекции в реално време на скоростта на подаване, предотвратявайки ограничаване или прехранване с глюкоза, което и в двата случая може да повлияе отрицателно на добива на продукта.

3. Статистическо планиране на експерименти (DoE)

DoE е систематичен подход за планиране и провеждане на експерименти за идентифициране на оптималните работни условия за даден процес. DoE може да се използва за оптимизиране на параметри на ферментацията като температура, pH, нива на хранителни вещества и скорост на аериране. DoE е много по-ефективен подход от традиционното експериментиране „един фактор наведнъж“.

Пример: Използването на DoE за оптимизиране на концентрациите на различни хранителни вещества във ферментационната среда може значително да подобри добива на продукта. Статистическият подход позволява идентифицирането на взаимодействия между хранителни вещества, които може да не са очевидни при традиционното експериментиране.

4. Усъвършенствани дизайни на биореактори

Разработени са няколко усъвършенствани дизайна на биореактори за подобряване на производителността на процеса. Те включват:

• Еърлифт биореактори: Тези биореактори използват въздух за осигуряване на смесване и пренос на кислород. Те са особено полезни за клетки, чувствителни на срязване.
• Мембранни биореактори: Тези биореактори използват мембрани за отделяне на клетките от ферментационната среда, позволявайки високи клетъчни плътности и непрекъснато отстраняване на продукта.
• Вълнови биореактори: Тези биореактори използват люлеещо се движение за осигуряване на смесване и аериране. Те са особено полезни за приложения в клетъчни култури.
• Биореактори за еднократна употреба: Тези биореактори са предварително стерилизирани и за еднократна употреба, което елиминира необходимостта от почистване и стерилизация и намалява риска от замърсяване.

Пример: Биореакторите за еднократна употреба все повече се използват в биофармацевтичната индустрия за производство на моноклонални антитела. Тези биореактори предлагат няколко предимства, включително намалени капиталови инвестиции, по-бързо време за изпълнение и по-нисък риск от замърсяване.

5. Модели за намаляване на мащаба (Scale-Down)

Моделите за намаляване на мащаба са малки биореактори, които са проектирани да имитират условията в широкомащабен биореактор. Тези модели могат да се използват за изучаване на въздействието на различни параметри на процеса върху растежа на клетките и образуването на продукт, без да е необходимо да се провеждат експерименти в широкомащабния биореактор. Това спестява време и ресурси.

Пример: Модел за намаляване на мащаба може да се използва за симулиране на ограниченията в преноса на кислород в широкомащабен биореактор. Чрез изучаване на въздействието на ограничението на кислорода върху растежа на клетките и образуването на продукт в модела, инженерите могат да разработят стратегии за преодоляване на тези ограничения в широкомащабния биореактор.

Стратегии за успешно разширяване на ферментацията

Успешното разширяване на ферментацията изисква добре планирана и изпълнена стратегия, която отчита предизвикателствата и използва наличните технологии.

1. Задълбочено разбиране на процеса

Дълбокото разбиране на ферментационния процес е от съществено значение за успешното разширяване. Това включва разбиране на включените метаболитни пътища, оптималните условия за растеж на клетките и критичните параметри на процеса, които влияят на добива и качеството на продукта. Разбирането на потенциалните инхибиторни фактори също е от решаващо значение. Солидната основа, изградена върху добре характеризирани експерименти в малък мащаб, е от съществено значение.

2. Разработване на надеждна посевна линия

Надеждната посевна линия е от решаващо значение, за да се гарантира, че клетките са здрави и активно растящи, когато се прехвърлят в широкомащабния биореактор. Посевната линия трябва да бъде проектирана така, че постепенно да адаптира клетките към средата с по-голям мащаб. Това често включва започване с малък инокулум в колба за разклащане и постепенно увеличаване на обема на инокулума чрез серия от прогресивно по-големи биореактори.

3. Прилагане на подходящ за фазата подход

Подходящият за фазата подход означава, че нивото на строгост и документация трябва да бъде съизмеримо с етапа на развитие. Разработването на процеса в ранен етап може да се съсредоточи върху идентифицирането на оптималните параметри на ферментацията, докато разработването на процеса в по-късен етап трябва да се съсредоточи върху оптимизирането и валидирането на процеса, за да се осигури постоянно качество на продукта и възпроизводимост.

4. Провеждане на пилотни проучвания

Пилотните проучвания са съществена стъпка в процеса на разширяване. Те ви позволяват да тествате ферментационния процес в биореактор, който е по-близък по размер до широкомащабния биореактор. Това ви позволява да идентифицирате потенциални проблеми и да оптимизирате процеса, преди да преминете към пълномащабно производство. Пилотните проучвания могат да разкрият проблеми със смесването, преноса на топлина или контрола на pH, които не са били очевидни в по-малък мащаб.

5. Наблюдение на критични параметри на процеса

Непрекъснатото наблюдение на критични параметри на процеса (CPPs) е от съществено значение за осигуряване на постоянно качество на продукта и възпроизводимост. CPPs включват температура, pH, разтворен кислород, клетъчна плътност и нива на хранителни вещества. Мониторингът в реално време позволява незабавни корекции на ферментационния процес, предотвратявайки отклонения от оптималните работни условия.

6. Внедряване на стратегии за контрол на процеса

Стратегиите за контрол на процеса са от съществено значение за поддържане на ферментационния процес в желания работен диапазон. Това включва внедряване на контури за обратна връзка за автоматично регулиране на параметри като температура, pH и разтворен кислород. Усъвършенствани стратегии за контрол, като моделно предсказващ контрол (MPC), могат да се използват за оптимизиране на ферментационния процес в реално време.

7. Разработване на подробен протокол за почистване и стерилизация

Подробният протокол за почистване и стерилизация е от съществено значение за предотвратяване на замърсяване и осигуряване на качеството на продукта. Протоколът трябва да включва подробни процедури за почистване и стерилизация на цялото оборудване и среди. Ефективността на протокола за почистване и стерилизация трябва да бъде валидирана, за да се гарантира, че е в състояние да отстрани всички замърсители.

8. Документация и проследимост

Подробната документация е от решаващо значение за доказване, че ферментационният процес е добре контролиран и че продуктът отговаря на всички изисквания за качество. Това включва документиране на всички параметри на процеса, суровини и аналитични резултати. Трябва да се поддържа изчерпателен одитен запис, за да се гарантира проследимостта на всички данни.

Глобални казуси за разширяване на ферментацията

Разглеждането на успешни истории за разширяване на ферментацията от цял свят предлага ценни прозрения и научени уроци.

1. Производство на инсулин в Дания

Novo Nordisk, датска фармацевтична компания, е световен лидер в производството на инсулин. Компанията успешно е разширила своите ферментационни процеси за производство на рекомбинантен инсулин в Saccharomyces cerevisiae. Ключови за техния успех са внедряването на усъвършенствани стратегии за контрол на процеса и използването на биореактори за еднократна употреба. Те също така използват усъвършенствани техники за последваща обработка, за да пречистят инсулина, за да отговорят на строгите регулаторни изисквания по целия свят.

2. Производство на биогорива в Бразилия

Бразилия е световен лидер в производството на етанол от захарна тръстика. Бразилските компании са разработили високоефективни ферментационни процеси за производство на етанол, който се използва като биогориво. Разширяването на тези процеси включва оптимизиране на щамовете дрожди, използвани за ферментация, подобряване на ефективността на ферментационния процес и разработване на надеждни техники за последваща обработка. Често се използва непрекъсната ферментация.

3. Производство на антибиотици в Индия

Индия е основен производител на антибиотици. Индийските фармацевтични компании успешно са разширили своите ферментационни процеси за производство на различни антибиотици, включително пеницилин и цефалоспорини. Това включва оптимизиране на условията на ферментация, подобряване на ефективността на ферментационния процес и разработване на надеждни техники за последваща обработка. Те също така са се фокусирали върху рентабилни производствени стратегии, за да се конкурират на световния пазар.

4. Производство на промишлени ензими в Китай

Китай е значителен производител на промишлени ензими. Китайските компании са разширили своите ферментационни процеси за производство на различни ензими, включително амилази, протеази и липази. Тези ензими се използват в широк спектър от индустрии, включително хранително-вкусовата, текстилната и производството на детергенти. Ефективната широкомащабна ферментация с използване на генетично модифицирани организми (ГМО) е обичайна практика. Предизвикателствата включват справяне с разнообразието от суровини и поддържане на контрол на качеството.

Бъдещето на разширяването на ферментацията

Областта на разширяване на ферментацията непрекъснато се развива, като се разработват нови технологии и стратегии за подобряване на производителността на процеса и намаляване на разходите. Някои от ключовите тенденции в разширяването на ферментацията включват:

• Повишена употреба на автоматизация и роботика: Автоматизацията и роботиката могат да помогнат за подобряване на ефективността и възпроизводимостта на ферментационните процеси.
• Разработване на по-ефективни дизайни на биореактори: Разработват се нови дизайни на биореактори за подобряване на смесването, преноса на кислород и преноса на топлина.
• Повишена употреба на процесна аналитична технология (PAT): PAT може да помогне за наблюдение на критични параметри на процеса в реално време, позволявайки незабавни корекции на ферментационния процес.
• Интеграция на анализ на данни и изкуствен интелект (AI): Анализът на данни и AI могат да се използват за оптимизиране на ферментационните процеси и прогнозиране на производителността на процеса.
• Акцент върху устойчивостта: Компаниите все повече се фокусират върху разработването на устойчиви ферментационни процеси, които минимизират отпадъците и консумацията на енергия.

Заключение

Разширяването на ферментацията е сложен и предизвикателен процес, но е от съществено значение за комерсиализацията на биотехнологични иновации. Като разбират ключовите принципи на разширяване на ферментацията, справят се с предизвикателствата, използват наличните технологии и прилагат добре планирана стратегия, компаниите могат успешно да разширят своите ферментационни процеси и да придобият конкурентно предимство на световния пазар. Непрекъснатите иновации и фокусът върху устойчивостта ще бъдат от решаващо значение за бъдещето на ферментационната технология в световен мащаб.